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肝癌是一种常见的恶性肿瘤， 调养步地以手术调养为主， 但其早期症状无特异性， 80%的患者在确诊时已失去手术契机， 只可经受非手术调养。化疗看成一种常用的非手术调养步地， 其毒反作用明显， 患者生计质料及医从性均较低[1]。因此， 可通过聚会化疗和其他非手术调养步地， 减少单一调养的毒反作用， 培育肝癌调养成果[2-3]。
声能源调养(sonodynamic therapy， SDT)是现今商量较为热点的一种调养步地， 指在一定的环境下， 超声波与声敏剂互相作用产生计性氧， 从而对组织形成损害。超声波具有高度聚焦、强穿透智商的性质， 使其在深部肿瘤调养中领有广阔的应用远景[4-6]。多半商量标明声能源调养中产生的生物学效应与其频率和强度密切相干， 但相干机制仍不解确， 需进一步探究。另外， 低功率聚焦超声(low intensity focused ultrasound， LIFU)不同于高强度聚焦超声(HIFU)的高温热消融作用[7]， 其关于东谈主体险些无毒反作用， 因此低功率聚焦超声与声敏剂联结， 可看成一种深部肿瘤调养的新计谋。
脂质体看成一种期骗时常的药物载体， 具有精粹的生物相容性， 其双分子层之间可容纳疏水性物资， 里面可装载亲水性物资， 利用此特色不错构建出一载体多功能的药物转运系统[8]。不弥漫磷脂是一种易与活性氧产生过氧化反应的磷脂， 该反应可使脂质体结构不结识。利用这类磷脂制备的脂质体可转运声敏剂及化疗药物同期收场超声截止药物开释[9]。由于该系统依赖于体外要素截止药物开释， 因此将成像功能与之相联结能更好地收场截止释药。全氟溴辛烷(1-bromoheptadecafluorooctane， PFOB)是一类性质结识的氟碳化合物， 由于其结构中的溴原子不易被射线穿过， 使得其可用于CT成像。由此可将PFOB包载在上述脂质体中， 监控脂质纳米粒在肿瘤位置的集结情况[10-11]。
因此， 本商量制备一种载血卟啉单甲醚包裹PFOB及阿霉素的声敏型脂质纳米粒， 聚会低功率聚焦超声检测其体外释药和产生计性氧的智商， 以及聚会声能源调养和化疗对HepG2细胞增殖的影响， 同期探究该脂质纳米粒体外CT成像的智商， 为后期的肝癌体内成像与调养提供了基础。
1 材料与法式 1.1 材料DLPC(二月桂酰基卵磷脂， 上海阿拉丁生化科技股份有限公司)， DPPC(二棕榈酸磷脂酰胆碱， Avanti Polar Lipids， Inc)， DSPG(二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸甘油， 钠盐， 瑞士卡登制药公司)， DSPE-PEG2000(二硬脂酰基磷脂酰酒精胺-聚乙二醇2000， 艾伟拓医药科技有限公司， 上海)， 胆固醇(生物工程股份有限公司， 上海)， HMME(血卟啉单甲醚， 源叶生物)， DOX(盐酸阿霉素， 北京索莱宝科技有限公司)， PFOB(全氟辛烷基溴化物， 上海麦克林生化科技股份有限公司)， DPBF(1， 3-二苯基异苯并呋喃， 上海麦克林生化科技股份有限公司)， HepG2细胞(上海中乔新舟生物科技有限公司)， CCK8(东仁化学科技有限公司， 上海)， DCFH-DA(2′， 7′-二氯荧光黄双乙酸盐， 好意思国能人生命技巧有限公司)。
1.2 仪器100 mL圆底烧瓶(苏州冠涵化工现实耗材厂)， RE-52B旋转挥发仪(上海亚荣生化仪器厂)， 高速散布均质机(上海标本模子厂)， 微量称样台(瑞士MettlerToleDo公司)， 超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)， 高速离心理(长沙平淡仪器仪容公司)， Malvern粒度仪(好意思国Malvern公司)， 紫外分光光度计(好意思国Thermo公司)， 荧光分光光度计(好意思国Agilent公司)， 恒温水浴锅(上海医疗器械厂)， ELX800酶标定量测定仪(BIOTEK公司)， 高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司)， 流式细胞计数仪(好意思国BD Biosciences公司)， 激光共聚焦显微镜(LSCM)(德国Leica公司)， CT(荷兰Philips公司)， 低功率聚焦超声(LIFU， 重庆医科大学超声影像学商量所)。
1.3 现实法式 1.3.1 SNL的制备经受薄膜水化法制备SNL， 具体法式参照文件[12-13]。①精密称取1 mg DLPC， 4 mg DPPC， 2 mg DSPG， 1.5 mg DSPE-PEG2000， 1.5 mg胆固醇和1 mg HMME于圆底烧瓶中; ②避光条目下， 加入适量三氯甲烷与甲醇充分融解磷脂和HMME; ③将圆底烧瓶置于旋转挥发仪上减压挥发1 h， 形成一均匀的暗红色薄膜; ④精密称取1 mg DOX融解于4 mL PBS中， 待充分融解后加入到上述烧瓶中; ⑤将烧瓶置于40 ℃水浴锅中平安摇晃， 直至暗红色薄膜王人备洗脱成暗红色悬液; ⑥将悬液移至10 mL EP管中， 再加入200 μL PFOB后， 用高速均质机乳化5 min， 经受12 000 r/min的转速， 肃除5 s， 得暗红色乳液; ⑦离心乳液(5 000 r/min， 5 min)， 弃上清液， 用PBS重悬千里淀， 清洗3次后得载PFOB包裹DOX的声敏型脂质纳米粒(SNL)， 置于4 ℃储存备用。用疏导的法式制备只包裹DOX或HMME以及两者均未包裹的载PFOB的脂质纳米粒(DNL、HNL、NL)和包裹DOX及HMME未载PFOB的脂质纳米粒。
1.3.2 SNL的一般性质经受普通光学显微镜和透射电子显微镜不雅察SNL的形色， 透射电子显微镜不雅察LIFU搞定后SNL的形色，萝莉少女 马尔文激光粒径仪检测SNL的粒径和电位， 紫外分光光度计检测DOX、HMME、NL、SNL和snl(snl为SNL突破离心后的上清液， 突破SNL的具体法式参见参考文件[14])的吸光光谱。
1.3.3 高效液相色谱法检测SNL的包封率平直测量法检测SNL中DOX和HMME的包封率， 具体法式参考文件[14]。用以下公式计较包封率。
HMME包封率=CHm/CHt×100%;DOX包封率=CDm/CDt×100%;CHm、CDm辩别默示包载于脂质纳米粒中的HMME和DOX的含量， CHt、CDt辩别默示HMME和DOX的总量。
1.3.4 SNL产生计性氧将SNL稀释为不同HMME浓度(1.25、2.5、5、10、20、40 μg/mL)的悬液， 各浓度辩别取1 mL与10μL DPBF(100 μg/mL)夹杂均匀， 用LIFU(0.2 W/cm2， 650 kHz， 脉冲2 s， 1 min)搞定该夹杂溶液。另取1 mL HMME浓度为10 μg/mL的SNL悬液与10 μL DPBF夹杂均匀， 用LIFU(0.4 W/cm2， 650 kHz， 脉冲2 s， 1 min)搞定。以DNL与DPBF的夹杂溶液作对照组， 每组设3个平行组， 荧光分光光度计检测每组剩余DPBF的荧光强度。用以下公式计较产生计性氧的相对量。
产生计性氧的相对量=(FIc-FIi)/FIc×100%;FIc为对照组的荧光强度， FIi为各现实组的荧光强度。
1.3.5 SNL体外释药将刚制备好的SNL稀释到一定浓度后分为等体积的A、B两组， 再将两组置于37 ℃恒温摇床中， 于1 h后离心各取1 mL上清液用高效液相色谱法检测其中DOX和HMME的含量(D1， H1)， 取出1 mL上清液后各组均补充1 mL PBS重新夹杂均匀， 再给予A组LIFU(0.2 W/cm2， 650 kHz， 脉冲2 s， 1 min)搞定， 后将两组置于37 ℃恒温摇床中， 疏导法式于2 h后取上清液检测其中DOX和HMME的含量(D2， H2)， 2 h后给予B组LIFU(0.4 W/cm2， 脉冲2 s， 1 min)搞定， 再置于37 ℃恒温摇床中。以疏导的法式于3、4、5、6、7、8 h后取两组上清检测DOX和HMME的含量(D3、H3、D4、H4、D5、H5、D6、H6、D7、H7、D8、H8)。用以下公式计较DOX和HMME的累计开释量。
积累开释DOX百分比=(2×Dn+ 
)/WD×100%;积累开释HMME百分比=(2×Hn+ 
)/WH×100%;Dn、Hn辩别为各时辰点测得的DOX和HMME的浓度， WD、WH辩别默示为稀释后的SNL中DOX和HMME的总量。
用含10%胎牛血清FBS和DMEM培养基， 5%CO2、37℃条目下培养， 每2天传代1次， 具体现实设施参照文件[15]。
1.3.7 SNL细胞内活性氧检测将细胞接种在激光共聚焦皿中， 分为3组:①SNL组; ②SNL+LIFU(0.2 W/cm2， 650 kHz， 脉冲2 s， 1 min)组; ③SNL+LIFU(0.4 W/cm2， 650 kHz， 脉冲2 s， 1 min)组。以DCFH-DA为活性氧探针， 具体现实设施参照文件[16]， 将各组置于激光共聚焦显微镜下不雅察。再通过流式细胞计数仪检测不同组中绿色荧光的强度。用上述相似的法式不雅察不同HMME浓度的SNL产生计性氧的情况。
1.3.8 SNL对HepG2细胞孕育的扼制作用经受CCK-8现实检测不同分组中HepG2细胞的存活率， 具体现实设施参照文件[15]。设为:①LIFU组; ②DOX组; ③DNL组; ④HNL组; ⑤HNL+LIFU组; ⑥SNL组; ⑦SNL+LIFU组， 每组4个复孔。其中HMME浓度辩别为20、10、5、2.5、1.25 μg/mL， DOX浓度辩别为20、10、5、2.5、1.25 μg/mL， SNL中的HMME和DOX浓度疏导， 孵育6 h后， LIFU(0.4 W/cm2， 650 kHz， 脉冲2 s， 1 min)搞定， 再孵育18 h， PBS清洗3次， 每孔加入100 μL 10% CCK-8， 孵育一定时辰后， 用酶标仪测450 nm处的光密度值D(450)。用以下公式计较细胞存活率， 同期经受SPSS软件计较各组的IC50。
细胞存活率=[D(450)加药-D(450)空缺]/[D(450)对照组-D(450)空缺]×100%
1.3.9 SNL体外CT成像将SNL配成不同PFOB浓度(386、193、96.5、48.25、24.125、12.0625)mg/mL的悬液， 以未包裹PFOB的SNL为对照组， 其中磷脂的浓度与包裹PFOB浓度中最高的SNL的磷脂浓度一致， 以PBS为空缺组， 行CT扫描。CT参数建筑:16排， 100 kV， 44 mA， 层厚0.29 mm[10]。
1.4 统计学分析经受SPSS 20.0统计软件进行分析， 计量贵寓经受x±s默示， 两样本均数的相比经受两孤苦样本t侦探， 各样本均数的相比经受单要素方差分析， 两变量之间的关系经受线性相干分析。侦探水准:α=0.05。
2 收尾 2.1 SNL的一般秉性光学显微镜下， SNL呈点状， 大小均匀， 散布无粘连(图 1A1)。透射电子显微镜久了SNL呈球形(图 1A2)， LIFU搞定后透射电子显微镜不雅察到SNL仍为球形， 但密度变浅(图 1A3)， 可能与SNL中包载的物资开释出来相干。紫外吸光图谱中(图 1B)， NL呈一平滑弧线， 未见明显接纳峰， DOX在480 nm处见一较小接纳峰， HMME和SNL均在390 nm处见明显的接纳峰， 可讲明注解SNL中包裹了HMME。snl中在480 nm处过头隔壁出现光密度值细微增高(图 1B箭头所指)。马尔文激光粒径仪测得SNL的粒径为(282.53± 6.95)nm(图 1C)， 电位为(-45.46±1.22)mV(图 1D)。
2.2 SNL的包封率SNL中DOX和HMME的包封率辩别为(80.15±15.11)%、(46.47±4.82)%， 两者的包封率均较高。
2.3 SNL产生计性氧SNL在LIFU(650 kHz， 0.2 W/cm2， 脉冲:2 s， 1 min)搞定后， 产生计性氧的相对量随HMME浓度增多而增多， 且各浓度组间两两相比， 产生计性氧的相对量互异有统计学敬爱(F=172.558， P < 0.05， 图 2)， 可见SNL产生计性氧呈HMME浓度依赖性。LIFU强度为0.4 W/cm2时， 产生计性氧的相对量为(63.93± 1.83)%， 较LIFU为0.2 W/cm2时的(55.56±2.32)%高， 互异有统计学敬爱(P < 0.05)， 可见SNL产生计性氧也呈LIFU强度依赖性。
成人游戏在线玩 2.4 SNL体外释药A组经LIFU搞定2h时出现明显的释药， 1 h内释药量DOX达31.75%， HMME为24.82%;B组在未经过LIFU搞定2 h后， DOX的释药量未超越10%， HMME的释药量均未超越5%;而B组在经过较高强度LIFU(0.4 W/cm2， 650 kHz， 脉冲2 s， 1 min)搞定后， 3 h时可见B组DOX在1 h内释药量为46.06%， HMME为32.13%， B组第3小时的释药量较A组第2小时的释药量多， 讲明较高强度的LIFU可加速释药。从之前SNL产生计性氧的现实中可知， 较高强度的LIFU可使SNL产生更多活性氧， 可能是因为更多的活性氧加速了磷脂过氧化， 使磷脂膜更不结识， 加速了药物开释， 可障碍讲明注解该药物寄递体系的释药经由与SNL的声敏性相干。8 h后A、B两组的DOX积累释药量辩别达到(83.45±2.97)%、(79.42±4.36)%， HMME的释药量辩别为(45.54±3.48)%、(47.37±5.60)%(图 3)， 可见在LIFU作用下， SNL可加速药物开释， 但由于HMME的水溶性较差， 使其释药量较DOX慢。
2.5 SNL产生计性氧的细胞现实活性氧探针DCFH-DA自己无荧光， 不错穿过细胞膜， 插足细胞内被酯酶水解产生水溶性DCFH， DCFH可被细胞内的活性氧氧化为DCF， 而DCF能产生绿色荧光。现实收尾久了， SNL组险些未见绿色荧光， SNL+LIFU(0.2 W/cm2)组绿色荧光较强， SNL+LIFU(0.4 W/cm2)组绿色荧光强于前两组(图 4)。可见在无LIFU作用时， 险些无活性氧产生， 当LIFU强度增强， 产生的活性氧增多， 该收尾与之前的现实收尾一致。不异， 不同HMME浓度的SNL与HepG2细胞共孵育后， 经LIFU搞定， 产生的绿色荧光跟着HMME浓度增多而增多(图 5)， 进一步讲明注解SNL产生计性氧呈LIFU强度及HMME浓度依赖性。流式细胞计数收尾与激光共聚焦显微镜不雅察收尾一致。
2.6 SNL对HepG2细胞孕育的扼制作用将NL与HepG2细胞共孵育24 h， 发现磷脂浓度在0.520 83~200 μg/mL之间HepG2细胞的存活率均高于85%， 互异无统计学敬爱(F=0.719， P>0.05， 图 6)， 可见磷脂浓度从0.520 83~200 μg/mL的NL险些无毒性。LIFU组HepG2细胞的存活率为(92.85± 2.36)%， 可觉得LIFU对细胞孕育险些无影响; 在疏导HMME或DOX浓度条目下， DNL组较DOX组的细胞存活率高， 互异有统计学敬爱(P < 0.05)， 该收尾可能与脂质纳米粒不错减缓药物开释相干; HNL+LIFU组的存活率较HNL组低， 互异有统计学敬爱(P < 0.05)， 可见单独的HNL对细胞孕育险些无影响， 而在聚会LIFU后， 明显扼制了细胞的孕育; 不异， SNL+LIFU组较SNL组的细胞存活率低， 互异有统计学敬爱(P < 0.05);SNL+LIFU组的细胞存活率较HNL+LIFU组、DNL和DOX组均低， 互异有统计学敬爱(P < 0.05)， 各组的IC50辩别为， DOX:0.624 μg/mL， DNL:0.894 μg/mL， HNL+LIFU:5.357 μg/mL， SNL:2.32 μg/mL， SNL+LIFU:0.571 μg/mL， 其中SNL+LIFU组的IC50最低， 可见SNL+LIFU组聚会声能源调养和化疗明显增强了对HepG2细胞的孕育扼制作用。而在不同浓度间， 疏导搞定组中细胞存活率存在明显的浓度依赖性， 互异有统计学敬爱(P < 0.05， 图 7)。
2.7 SNL体外CT成像跟着PFOB浓度的镌汰， CT成像密度渐渐镌汰， 对照组及空缺组的密度明显低于其他组(图 8A)， 同期， 通过PFOB浓度-CT值弧线可见SNL的CT值跟PFOB浓度具有精粹的相干性(图 8B)， 具体CT值见表 1。
3 揣测声能源调养， 是利用超声引发声敏剂， 基于声孔效应、声化学效应及声致光效应产生ROS杀死肿瘤细胞。其中超声具有高聚焦、强穿透力的特色， 因此， 其在深部肿瘤的调养中具有一定的商量价值。本商量以HMME看成声敏剂， 并告成将HMME包裹进声敏型脂质纳米粒中。在探究SNL的声能源成果时， 发现SNL产生计性氧， 与HMME的浓度和LIFU的强度有密切关系， 呈现HMME浓度及LIFU强度依赖性， 且该收尾与文件[17-18]报谈一致。其中可能的机制为， LIFU产生的空化效应使轻飘的空化泡一会儿突破时， 集结起来的声场能量一会儿开释， 进一步在局部微环境产生高温高压、声致光等效应， 其中的能量或使声敏剂HMME与周围环境中的水(H2O)、氧气(O2)之间发生电子的迁徙， 从而产生羟基解放基(-OH)、单线态氧(1O2)、超氧根离子(O2﹣)[19-20]。
药物转运系统， 由于可减少化疗药物的毒反作用而取得了时常的商量。其中有依赖于肿瘤里面微环境的pH反映型、酶反映型转运系统， 也有受外部条目截止的热反映型、光反映型、超声反映型转运系统[21]。本商量以声敏型脂质体为载体， 同期将DOX包载在声敏型脂质纳米粒的亲水层， 利用LIFU作用于声敏剂可产生计性氧， 以及活性氧易使不弥漫磷脂发生过氧化反应这两个特色， 构建了一种活性氧反映型的药物转运系统， 告成收场了LIFU促进声敏型脂质纳米粒的药物开释。现实收尾中可见跟着LIFU强度的增强， 释药速率加速， 进一步讲明了LIFU与声敏剂互相作用产生的活性氧可能加速了药物开释。
化疗看成肝癌常见的一种非手术调养步地， 由于其毒反作用强， 常与其他调养步地相联结。本现实制备的SNL告成地将声能源调养与化疗联结， 增强了扼制HepG2细胞的孕育。同期， 该转运系统包载了PFOB， 使SNL具有了CT成像的智商。因此， 该系统可用CT监测SNL在肝脏癌灶的集结情况， 收场诊疗一体化。
要而论之， 本现实告成制备的载HMME包裹PFOB及DOX的声敏型脂质纳米粒163性爱网， 收场了LIFU截止释药， 聚会声能源及化疗增强扼制HepG2细胞孕育以及体外CT成像。为后期体内成像与调养提供了基础。